Шведські вчені розробили методику, що дозволяє виділяти зі зразка тканини окремі клітини і аналізувати в них експресію генів. Результати роботи опубліковані в журналі.
Співробітники Каролінського інституту використовували комбінацію двох методів: лазерної захоплюючої мікродісекції (ЛЗМ, LCM) і повного транскриптомного аналізу за допомогою технології секвенування РНК Smart-seq2. Принцип ЛЗМ полягає в тому, що за допомогою мікроскопа в зразку тканини вибирають цікаву клітку, після чого зразок накривають прозорою плівкою і лазером «приклеюють» до неї цікаву клітку, не руйнуючи її. Smart-seq2 дозволяє синтезувати на основі матричних РНК (мРНК) єдиної клітини повнорозмірні комплементарні ДНК (кДНК), які потім підсилюють методом ПЛР і секвенують.
Поєднання ЛЗМ з аналізом транскриптома використовували і раніше, проте такі методики вимагали від 200 до 4000 клітин для отримання достатньої кількості РНК для аналізу. Однак у ряді випадків необхідно оцінити різницю в експресії генів між окремими схожими клітинами в невеликому зразку тканини. Застосування Smart-seq2 і декількох удосконалень комбінованої методики дозволило вченим з достатньою точністю оцінити транскриптом одиничних клітин.
Під час роботи дослідники приготували 12-мікрометрові зрізи тканини спинного мозку новонароджених мишат і візуалізували в них рухові нейрони спеціальним барвником. При цьому вони успішно використовували не стандартний дорогий набір реактивів, а фіксували клітини звичайним зневодненим етанолом. Виділені за допомогою ЛЗМ окремі клітини піддавали прямому лізису гіпотонічним розчином і без екстракції та очищення РНК, необхідних для стандартних методик секвенування, проводили Smart-seq2.
Експеримент почали зі 120 нейронів, поступово знижуючи їх кількість до 50, 30, 10, 5, 2 і 1 клітини. З'ясувалося, що вихід кДНК при використанні прямого лізису 50, 30 і 10 клітин можна порівняти з результатами екстракції РНК і навіть дозволяє виділити з одиниці зразка в середньому більше генів (на думку дослідників, це відбувається через втрату частини генетичного матеріалу в ході очищення РНК). Більш того, нова методика, названа LCM-seq, забезпечила рівень успішного повнотранскриптомного аналізу в 62 відсотки для однієї клітини, 81 відсоток для двох клітин і 100 відсотків для зразків, що містять п'ять і більше клітин.
Ефективність LCM-seq підтвердили, виявивши з її допомогою різницю в експресії генів у близьких за структурою і функціями рухових нейронів з різних ділянок спинного мозку миші. Після цього, використовуючи методику, вчені успішно визначили різницю транскриптомів схожих мотонейронів з посмертних зразків спинного мозку хворих на бічний аміотрофічний склероз, а також чорної субстанції та вентральної покришкової області головного мозку пацієнтів з хворобою Паркінсона.
Таким чином, LCM-seq підходить для аналізу експресії генів в окремих клітинах навіть у вкрай малих або частково розкладених зразках тканин, пишуть дослідники. Один з них, Цяолінь Ден (Qiaolin Deng), зазначив, що вона простіше, дешевше і володіє набагато більшою чутливістю і відтворюваністю, ніж існуючі методики. На думку вчених, їх розробка може знайти широке застосування в різних галузях біології та медицини, в тому числі у вивченні розвитку раку та ідентифікації його біомаркерів.