Вченим вдалося прочитати геном людини за допомогою «кишенькового» приладу для секвенування MinION розміром зі смартфон. У статті, опублікованій в, також описаний поставлений за допомогою того ж пристрою рекорд за найдовшим прочитанням молекули ДНК - довжина безперервного прочитання склала 882 тисячі пар підстав.
Незважаючи на те, що на сьогоднішній день прочитані геноми десятків видів тварин, а вартість секвенування знизилася на порядки порівняно з першими подібними експериментами, визначення повної послідовності ДНК еукаріотичних організмів все ще являє собою нетривіальне завдання. В основному це пов'язано з тим, що значна частина геному являє собою повторювані послідовності - мікросателітну ДНК, тандемні повтори, ретроелементи і так далі.
Найпоширеніша технологія високопродуктивного секвенування ДНК на сьогодні передбачає розбиття молекули ДНК на маленькі шматочки в кілька сотень пар підстав, їх ампліфікацію (розмноження) і прочитання. З таких маленьких шматочків за допомогою математичних алгоритмів потім відновлюють повну послідовність генома (цей процес називається збіркою). Багато ділянок ДНК, особливо містять повтори, при цьому взагалі випадають, або дослідники не впевнені в їх точній послідовності. Навіть у референсному геномі людини, яку вперше опублікували 2001 року, досі є прогалини.
Щоб цього уникнути, інженери зосередилися на технологіях секвенування, які дозволяють визначати послідовність якомога довшої молекули ДНК, причому бажано без ампліфікації. На сьогоднішній день найпопулярнішим рішенням для прочитання і складання великих геномів була технологія компанії PacBio, що дозволяє безперервно прочитати кілька десятків тисяч пар. Для маленьких геномів, наприклад, бактеріальних, компанія Oxford Nanopore Technologies у 2014 році запропонувала «кишеньковий» секвенатор MinION, який також здатний безперервно прочитувати довгі послідовності, але при цьому обмежений за ємністю.
MinION являє собою прилад розміром зі смартфон, який підключається до комп'ютера через USB-кабель. Принцип його дії заснований на вимірюванні електричної провідності під час простягання молекули ДНК через пору в мембрані приладу. Вартість приладу і стартового набору реактивів становить тисячу доларів, що порівняно з іншими існуючими технологіями досить дешево. Розробники позиціонують його як польовий секвенатор, який може бути використаний «в джунглях, в Арктиці, на космічній станції». На підтвердження тому нещодавно за допомогою MinION на МКС дійсно прочитали кілька послідовностей ДНК, в тому числі мітохондріальний геном миші.
Дослідники з декількох американських і канадських інститутів, у тому числі університету Каліфорнії і Національного дослідницького інституту геному людини (США) показали, що за допомогою MinION можна успішно прочитати геном людини. Більш того, вчені оптимізували протокол секвенування для прочитання ультра-довгих фрагментів ДНК в сотні тисяч пар підстав.
Розмір геному людини становить приблизно 3 мільярди пар підстав (три гігабази). Прочитання ДНК клітинної лінії людини GM12878 було проведено силами співробітників п'яти лабораторій, в роботі було використано 39 робочих осередків MinION і оптимізований протокол пробопідготовки. У підсумку вчені отримали 91,2 гігабаз даних, що відповідає 30-кратному покриттю геному. Довжина більше половини прочитаних фрагментів ДНК склала 100 тисяч пар підстав і більше. Додатково дослідники показали, що з оптимізованим протоколом можливе визначення послідовності ДНК до 882 тисяч пар підстав. Фактично, максимальна довжина прочитання визначається тільки якістю виділення ДНК.
Для об'єднання послідовностей в одну авторам довелося оптимізувати також алгоритми складання, оскільки більшість існуючих програм заточені під короткі фрагменти. Після порівняння з референсним геномом лінії GM12878, який був прочитаний більш традиційними методами багато разів, виявилося, що отримана послідовність покриває 85,8 відсотків геному, а точність збірки наближається до 100 відсотків.
Прочитання таких довгих фрагментів ДНК під час секвенування дозволило авторам заповнити прогалини в послідовності людського геному і спростити аналіз багатьох його ділянок. Наприклад, локус головного комплексу гістосумісності (HLA) має складну структуру і безліч повторів, тому його послідовність дуже складно визначати. У даному випадку всі гени потрапили в одну безперервну прочитану послідовність, що позбавило дослідників від необхідності копітко збирати її зі шматочків. Крім цього, вчені продемонстрували можливість розпізнавати за допомогою цієї технології секвенування епігенетичні мітки, зокрема, метилювання ДНК, що з іншими технологіями було неможливо.
Секвенування геному людини є своєрідною контрольною точкою у визначенні продуктивності технології. Дана робота обіцяє подальше спрощення і здешевлення не тільки безпосереднього визначення послідовності ДНК, але і її аналізу. Детальніше про історію розвитку технологій секвенування ДНК можна прочитати в нашому матеріалі.