Китайські вчені суттєво підвищили ефективність вирощування дорослих мишей з геномами від двох матерів, але без батьківського. Також вперше їм вдалося отримати живих мишат від двох батьків. Цього вдалося досягти за рахунок використання ембріональних стовбурових клітин і вимикання певних ділянок в їх геномі, що працюють по-різному залежно від того, від якого батька вони отримані. Дослідження опубліковано в журналі.
Партеногенез - форма розмноження, при якій статеві клітини розвиваються в дорослий організм без запліднення взагалі, або без злиття ядра сперматозоїда з ядром яйцеклітини після запліднення (такий варіант називається гіногенез). Такий процес зустрічається у декількох десятків видів тварин, у тому числі і хребетних (ящірок, амфібій, риб, птахів). Найчастіше таким способом розмножуються самки, проте показані подібні випадки і у самців деяких риб. Для ссавців випадків партеногенезу в природі поки не відомо. Випадків, коли життєздатне потомство заводять одностатеві батьки, також поки не спостерігалося.
У даному проекті вчені працювали з феноменом геномного імпрінтингу. Це епігенетичний процес, в результаті якого ген працює по-різному залежно від того, отриманий він від батька чи від матері. Успадкування відповідних ознак тому відбувається не за класичним менделівським принципом. Наприклад, алель гена IGF2 (інсуліноподібного фактора росту) працює в тому випадку, якщо він успадкований від батька. Успадкований від матері такий же алель працювати не буде. Імпрінтинг здійснюється за рахунок метилювання ДНК в промоторній області вимикання гена, в результаті чого його транскрипція блокується. У геномі такі гени найчастіше розташовані групами (імпринтингові ділянки хромосоми). У ссавців їх відомо близько ста.
Однією з основних теорій, що пояснюють феномен геномного імпринтингу, є теорія батьківського протистояння. Вона передбачає, що батьки мають різні «цілі» в контексті еволюційної пристосованості і продовження роду. Гени батька «прагнуть» збільшити успіх потомства, в тому числі за рахунок здоров'я матері під час вагітності і після. Гени матері, навпаки, «прагнуть» зберегти материнські ресурси для того, щоб вона вижила і забезпечила життєздатність не тільки цього, але і наступних поколінь.
Різниця між геномами батька і матері, в тому числі, що стосується геномного імпрінтингу, лежить в основі бар'єрів, що перешкоджають одностатевому розмноженню, і стимулює взаємовигідний обмін генетичною інформацією між різностатевими особинами, а також сприяє поширенню корисних мутацій в популяції і підтримці конкурентноздатності у потомства.
Ще в 2004 році іншій групі дослідників вже вдавалося отримати мишат від двох матерів без батька, використовуючи незрілі яйцеклітини і вимикаючи в доданих до них геномах ділянку піддається імпрінтингу гена H19. Одна така миша навіть виросла в дорослу особину і виявилася здатна давати власне потомство.
На даний момент, відзначають вчені, ясно, що багато аспектів, що визначають бар'єри, пов'язані з одностатевим розмноженням, поки що не відомі. Так, з'являються все нові дані про гени, схильні до імпрінтингу, які поки не дають повної картини того, що відбувається.
У цьому проекті вчені брали ДНК з ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) - це клітини, отримані з бластоцисти на ранній стадії розвитку ембріона (5-6 днів після запліднення, такий ембріон складається з 50-150 клітин). ЕСК плюрипотентні - вони можуть розвинутися в усі типи клітин дорослого організму. Їх можна піддавати культивуванню, в тому числі, в гаплоїдній формі (гаЕСК), коли в клітці зберігається ДНК тільки від одного з батьків.
З'ясувалося, що гаЕСК за своїми властивостями підходять як донори ДНК. Вони гіпометильовані, тобто їх ДНК набагато меншою мірою метильована, ніж ДНК яйцеклітин, сперматозоїдів і фібробластів. Найбільше їх тип метилування нагадував первинні статеві клітини, гоноцити, які з'являються на 10,5 день розвитку ембріона. При більш детальному аналізі конкретних ділянок геному ЕСК з'ясувалося, що в їх випадку, дійсно, можна говорити про відсутність імпринтингових ефектів.
За рахунок ін'єкції в незрілі яйцеклітини гаЕСК з вимкненими за допомогою технології CRISPR-Cas9 імпринтинговими ділянками H19 і IG (як виявилося, миша набагато успішно виживали, якщо ділянки були обидва вимкнені) вдалося отримати життєздатних мишат від двох матерів. Однак такі мишата мали суттєві дефекти розвитку, крім того, вони рухалися повільніше і могли долати менші відстані порівняно з диким типом. Порівняльний аналіз роботи генів їх мозку і мозку мишей дикого типу виявив різницю в роботі трьох генів, схильних до імпрінтингу -, і. Вони відповідали за малу активність, когнітивну діяльність і пам'ять.
Дивним був той факт, що експериментальні миші при цьому прожили довше мишей дикого типу. Порівняльний аналіз факторів, що впливають на метаболізм, виявив зниження роботи гена, який у людей є фактором, що негативно впливає на тривалість життя. Крім того, у партеногенетичних мишей виявився знижений рівень холестерину.
У новому експерименті вчені на додаток до H19 і IG вимкнули також і область гена. У результаті з 210 ембріонів вижили цілих 29 (14 відсотків - порівняно з роботою 2004 року це більш ніж десятикратне збільшення ефективності методу). Загальні рівні метилювання геному у таких мишат були схожі з контрольними, і всі їх імпринтингові гени експресувалися нормально. Робота гена також відповідала нормі.
Мишей, отриманих від двох матерів, схрестили з нормальними мишами, в результаті чого народилося в цілому 22 мишат (з 6 виводків). Дев'ять мишат (з вимкненими окремо ділянками H19 або IG) померли, а решта 13 виросли в дорослих особин.
Для експерименту з двома батьками знадобилося вимикати більшу кількість ділянок. У попередніх роботах вже було показано, що ембріони з ДНК двох батьків помирали на набагато більш ранніх стадіях порівняно з експериментами з ДНК самок. Вчені вибрали шість імпрінтингових ділянок (Nespas, Grb10, Igf2r, Snrpn, Kcnq1, Peg3), вимкнули їх у чоловічих гаЕСК і провели ко-ін'єкцію таких геномів разом зі сперматозоїдами в без'ядерні яйцеклітини. З 1144 ембріонів, однак, жоден не зміг виростити плаценту і не вижив.
В якості альтернативної стратегії вчені зробили диплоїдні ЕСК, щоб створити тетраплоїдні ембріони, в надії, що у них зможе розвинутися нормальна плацента. Всього було зроблено 1023 ембріони, з яких 12 (1,2 відсотка) народилися живими. Невдовзі після народження вони померли. Їх вага була в два рази вище звичайного і вони володіли іншими дефектами розвитку, в тому числі страждали водянкою і не могли нормально дихати і смоктати молоко.
Виявилося, що у таких мишей спостерігалося гіпометилювання ділянки Gnas і відповідний ген погано експресувався. Дослідники вимкнули ще одну ділянку, що відноситься до цього гену (він входив в область Nespas) і створили 477 ембріонів з уже 7 вимкненими ділянками. Живими народилися 12 мишат (2,5 відсотків), їх вага та інші ознаки були значно ближче до дикого типу. Двом мишатам, у яких ознаки водянки повністю були відсутні, вдалося прожити дві доби.
Аналіз метилювання геномів таких мишей виявив, що, хоча в цілому воно теж виявилося подібно до дикого типу, ряд імпринтингових ділянок у експериментальних мишей був недостатньо метильований, і відповідні гени (наприклад,,,,,, і) експресувалися не так, як у дикого типу. Очевидно, у вирішенні цієї проблеми лежить ключ до подальших експериментів.
Окремо вчені відзначають, що той факт, що два материнських геноми знижували вагу мишеняти, а два батьківські його підвищували, на їхню думку, підтримує теорію «батьківського протистояння», оскільки на вирощування великого ембріона і, згодом, мишеня, мати витратить набагато більше власних ресурсів, а дрібне потомство забезпечить більше шансів вижити їй самій.
Нагадаємо, що якщо подібні експерименти з ссавцями складні і вимагають безлічі проб і помилок, то деяким термітам, що живуть в дикій природі, судячи з усього, взагалі все одно, розвиватися з запліднених яєць або з неоплідних.