Генетики адаптували для використання в клітинах людини CRISPR-систему першого класу Cascade/Cas3, в якій для розпізнавання і розрізання ДНК використовується не один, а безліч білків. Як повідомляється в статті в, завдяки здатності білка Cas3 вносити численні розрізи на протяжних ділянках ДНК, цю систему можна використовувати для створення великих делецій в людському геномі.
CRISPR-системи, які були відкриті як компонент бактеріального «імунітету» проти вірусів, в природі досить різноманітні, і включають як системи з одним білком-ефектором, так і з кількома. Функції розпізнавання заданої послідовності та розрізання ДНК у системах другого класу виконує єдиний білок, що робить їх особливо привабливими для біотехнології. Сюди відноситься система, що включає нуклеазу Cas9, яка в даний активно використовується для редагування геномів найрізноманітніших організмів. Тим не менш, такі системи становлять не більше 10 відсотків від відомих CRISPR-систем.
Найпоширеніші в природі CRISPR-системи першого класу і першого типу включають в себе кілька ефекторів. Функції розпізнавання послідовності тут грає багатосуб'єдиночний комплекс Cascade, а розріз в ДНК вносить хеліказа-нуклеаза Cas3. Робота комплексу Cascade/Cas3 інтенсивно вивчається в бактеріях, але в еукаріотичних клітинах її досі не використовували.
Дослідники з Корнельського університету та Університету Мічигану вирішили перевірити, як найбільш вивчений Cascade з термофільної бактерії поведе себе в ембріональних клітинах людини (ці клітини були обрані як «здорова» клітинна модель). Щоб доставити комплекс в клітини, вчені експресували в бактеріях всі сім суб'єднань Cascade з пришитим до них сигналом ядерної локалізації, потім змішували їх з направляючої РНК і Cas3, і доставляли в клітини за допомогою електропорації. Щоб комплекс працював при 37 градусах, в одну з суб'єднанок ввели мутацію.
Ефективність редагування перевіряли на прикладі репортерних генів - зеленого і червоного флуоресцентного білків. Виявилося, що незважаючи на складність збірки комплексу, він добре працює в людських клітинах, точно розпізнає задані послідовності і вносить розриви у вищележну послідовність ДНК. Комплекс вносив розрив приблизно в десяти відсотках клітин, максимальна ефективність редагування для обраних напрямних РНК склала 13 відсотків. Тим не менш, у випадку іншого гена в раковій клітинній лінії HAP1 ефективність редагування склала вже 30-60 відсотків.
Однією з цілей авторів роботи було уточнення механізму роботи білка Cas3. На відміну від Cas9, він не вносить одиночний розрив у місці розпізнавання, а «приїжджає» на Cascade в потрібне місце, потім від'єднується і їде по ДНК ще досить далеко. Виявилося, що в еукаріотичних клітинах в результаті роботи комплексу утворюються досить великі делеції розміром від декількох сотень до десятків тисяч пар підстав. Мабуть, Cas3, проїжджаючи по ДНК, вносить кілька одно- або дволоніпочкових розривів, таким чином нарізаючи досить довгу послідовність ДНК на шматочки.
Звичайно, якщо говорити про практичне застосування в людських клітинах, для точного редагування Cascade/Cas3 не годиться, зауважують автори роботи. Однак понад 90 відсотків людського геному становлять некодуючі послідовності, і для вивчення їхніх функцій нерідко потрібно видаляти досить тривалі ділянки хромосом. У цьому випадку Cascade міг би поповнити генетичний інструментарій для еукаріот.
Крім найбільш вивченого білка Cas9 для редагування геному людини вчені пропонували використовувати й інші білки CRISPR систем другого класу - Cas12a (Cpf1), Cas13a, яка може вимикати гени на рівні мРНК, і нещодавно виявлений «маленький» аналог Cas9 - CasX.